Cas9 : définition, utilisation en génie génétique, édition CRISPR/Cas9 avec amorce et endonucléases similaires

Cas9 (CRISPR associated protein 9, protéine associée à CRISPR) est une endonucléase contrôlée par des guides d’ARN associés au système immunitaire adaptatif CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) chez un certain nombre de bactéries, notamment Streptococcus pyogenes. Celle-ci utilise Cas9 pour se souvenir,  puis inspecte et coupe l’ADN étranger, comme l’ADN des bactériophages ou des plasmides. Cas9 effectue la vérification en déroulant l’ADN étranger et en déterminant sa complémentarité avec l’espaceur d’ARN guide à vingt paires de bases. Si le substrat est complémentaire de l’ARN guide, Cas9 clive l’ADN étranger. En ce sens, le mécanisme CRISPR-Cas9 présente un certain nombre de parallèles avec le mécanisme d’interférence ARN (ARNi) chez les eucaryotes. La sécurité de l’application pratique de cette méthode est déterminée, entre autres, par le fait que la séquence souhaitée de vingt bases appariées est unique dans l’ADN modifié.

Utilisation de Cas9 en génie génétique

En plus de sa fonction originale dans l’immunité bactérienne, la protéine Cas9 est activement utilisée pour créer des cassures ponctuelles dans la double hélice de l’ADN. De telles cassures peuvent conduire à l’inactivation de gènes ou à la création de gènes hétérologues par la connexion d’extrémités non homologues et la recombinaison homologue correspondante. Avec les protéines ZFN et TALEN, Cas9 devient un outil important pour l’édition du génome.

L’un des premiers à démontrer le clivage programmé de l’ADN par la protéine Cas9 fut le biochimiste lituanien Virginijus Šikšnis, mais son article n’a pas été accepté pour examen par Cell Reports le 18 avril 2012. Un mois plus tard, il l’a soumis au PNAS, où il a fallu plusieurs mois pour l’examiner et le publier. Pendant ce temps, la biochimiste américaine Jennifer Daudna et la microbiologiste française Emmanuelle Charpentier ont publié leur article dans la revue scientifique à comité de lecture Science, où il a été examiné et accepté en deux semaines. Emmanuelle Charpentier et Jennifer Daudna ont reçu le prix Nobel de chimie 2020 pour la création de nouvelles technologies permettant l’édition du génome à l’aide de CRISPR-Cas9.

En 2012, Cas9 avait gagné en popularité car il pouvait cliver pratiquement n’importe quelle séquence nucléotidique complémentaire à l’ARN guide. Puisque la sélectivité de Cas9 est une conséquence de la complémentarité de l’ARN guide et de l’ADN, et non d’une modification de la protéine elle-même (contrairement au cas de TALEN et ZFN), la production de Cas9 spécifique pour de nouvelles cibles d’ADN est possible. Les variantes de Cas9 qui se lient à l’ADN mais ne le clivent pas (dCas9) peuvent être utilisées pour délivrer des activateurs ou des répresseurs transcriptionnels à des séquences d’ADN spécifiques afin de réguler l’activation et la répression transcriptionnelles. Bien que Cas9 naturel nécessite qu’un ARN guide soit composé de deux ARN fondamentalement différents, l’ARN CRISPR (ARNc) et l’ARN de transactivation (tracrRNA), le ciblage de Cas9 a été simplifié par la génération d’un seul ARN guide chimérique. On suppose que Cas9 peut être utilisé pour modifier le génome de populations entières d’organismes. En 2015, Cas9 a été utilisé pour la première fois pour modifier le génome d’un embryon humain. Une technologie a été développée pour l’ingénierie immunogénomique des hybridomes, qui permet de reprogrammer rapidement la spécificité de leurs anticorps à l’aide de Cas9.

Une technologie a été créée qui permet d’éditer des «lettres» individuelles d’ADN et d’ARN sans couper la chaîne d’ADN, mais en convertissant une base nucléotidique en une autre, ce qui permettra de traiter les maladies congénitales causées par des mutations ponctuelles. Grâce aux cytidine désaminases ou aux adénosine désaminases reliées à dCas9, on peut désactiver l’expression (en introduisant des codons d’arrêt prématurés) ou modifier l’épissage nécessaire à la synthèse de certaines protéines. La technologie MAGESTIC (multiplexed accurate genome editing with short, trackable, integrated cellular barcodes, édition multiplexée précise du génome avec des codes-barres cellulaires courts, traçables et intégrés) a été créée, qui non seulement clive l’ADN, mais délivre également un morceau d’ADN nécessaire à un remplacement précis au site de cassure (via la protéine de liaison à l’ADN hybride LexA-Fkh1p), ce qui améliore la précision et l’efficacité de l’édition. Un autre outil pour l’insertion ciblée d’ADN peut être la transposase associée à CRISPR CAST (CRISPR-associated transposase, transposase associée à CRISPR) de la cyanobactérie Scytonema hofmanni. ShCAST catalyse la transposition d’ADN guidée par l’ARN par insertion unidirectionnelle de segments d’ADN de 60 à 66 pb en aval du protospacer.

Il est surprenant qu’en raison des restrictions liées aux brevets, la technologie d’édition Cas9 ne soit pas accessible aux scientifiques du monde entier, mais uniquement aux titulaires de brevets, ce qui constitue un obstacle au progrès de la science et au développement de médicaments pour les personnes atteintes de maladies graves.

Utilisation de dCas9

En combinant la molécule dCas9 inactivée, qui lie l’ADN mais ne le clive pas, avec la nucléase FokI, il est possible d’obtenir des nucléases et des enzymes de restriction pour une coupe hautement sélective de l’ADN. Une méthode a également été développée pour la reprogrammation épigénétique sélective de l’activité des gènes à l’aide d’une molécule dCas9 inactivée connectée à une enzyme qui effectue la déméthylation de l’ADN. De plus, une telle reprogrammation de l’épigénome peut être réalisée même in vivo. Plus tard, il s’est avéré que si l’ARN guide est raccourci à 14-15 nucléotides, la molécule Cas9 perd la capacité de couper l’ADN. Grâce à cette propriété, il a été possible de créer un système d’activation sélective de certains gènes in vivo et de tester son efficacité en traitant des souris atteintes de maladies simulées.

Il n’y a qu’un seul problème avec cette méthode: généralement, le système CRISPR est chargé dans un virus inoffensif appelé virus adéno-associé (AAV), qui transporte le système dans une cellule. Mais la protéine entière, composée de dCas9 et d’ARN guide, est trop volumineuse pour tenir dans un seul AAV. Pour contourner ce problème, les chercheurs ont chargé dCas9 dans un virus et l’ARN témoin dans un autre. Des lignées de souris transgéniques ont été créées pour une régulation génique ciblée in vivo en éditant l’épigénome à l’aide des systèmes dCas9p300 et dCas9KRAB. Ces souches de souris sont des outils utiles pour manipuler l’expression des gènes in vivo avec divers ARN guides.

L’efficacité de la molécule dCas9 est renforcée par un ensemble polypeptidique répétitif d’antigènes répétitifs, appelé SunTag, qui peut attirer plusieurs copies d’anticorps associés à une enzyme d’édition épigénétique ou à un support d’étiquette fluorescente. Une autre application de dCas9 est la modification programmable des acides aminés dans les protéines chromatiniennes. Par exemple, l’histone protéine kinase artificielle dCas9-dMSK1 permet de réaliser une hyperphosphorylation de la sérine 28 dans l’histone H3 (H3S28ph), qui joue le rôle de «bouton de démarrage» dans l’activation sélective des promoteurs, et ainsi d’augmenter la expression de gènes sélectionnés.

De nouvelles façons de délivrer Cas9 dans les cellules

Les principales exigences du système de délivrance Cas9, en plus d’une efficacité de délivrance élevée, sont les suivantes : (1) la construction synthétisant Cas9 ne doit pas être intégrée dans le génome cellulaire et ne doit pas être permanente dans la cellule afin de ne pas interférer avec le fonctionnement de la cellule et ne pas provoquer de réactions immunitaires ; (2) le véhicule d’administration doit être capable de contenir une enzyme Cas9 suffisamment grande ou l’ARNm la codant, ainsi qu’un ou plusieurs ARN guides ; (3) il doit être pratique pour l’injection ; (4) un tel médicament, associé à Cas9 et aux ARN guides, devrait être suffisamment facilement reproductible pour la production à grande échelle d’un médicament destiné à lutter contre les maladies courantes.

Contrairement aux systèmes de délivrance virale, les nanoparticules lipidiques répondent à ces critères. Par exemple, un système d’administration cas9 biodégradable avec une nanoparticule lipidique a été créé, ce qui a permis d’obtenir in vivo plus de 97% d’inhibition du niveau d’une des protéines du sérum sanguin après une seule administration. Dans le même temps, une telle administration unique, malgré la nature temporaire du système d’administration et des composants du système d’édition, a conduit à une inhibition à long terme durant 12 mois. Les vésicules extracellulaires sont également utilisées pour la livraison.

Cependant, le développement de particules virales pour délivrer Cas9 et sgRNA se poursuit. L’un de ces développements est NanoMEDIC (nanomembrane-derived extracellular vesicles for the delivery of macromolecular cargo, vésicules extracellulaires dérivées de nanomembranes pour la délivrance de marchandises macromoléculaires). NanoMEDIC a induit efficacement l’édition du génome dans divers types de cellules humaines, telles que les cellules T, les monocytes, les iPSC, les neurones corticaux dérivés des iPSC, et les cellules myogéniques.

Étant donné que les méthodes existantes d’introduction des systèmes CRISPR-Cas dans les cellules à l’aide de virus porteurs et d’impulsions électriques ne sont pas suffisamment efficaces pour les cellules prélevées directement sur les patients (les cellules dites primaires), il a été proposé d’utiliser une combinaison de deux peptides modifiés (l’un du virus VIH et un du virus de la grippe) facilitant la pénétration des molécules CRISPR-Cas9 et Cas12a à travers la membrane externe des cellules primaires et dans le noyau, où se trouve la majeure partie de l’ADN cellulaire. Cela a réduit le temps d’incubation et augmenté l’efficacité de l’édition génétique jusqu’à 98 %. La méthode est appelée PAGE (Peptide-Assisted Genome Editing).

Les protéines Cas plus compactes sont plus faciles à transporter dans les cellules pour l’édition du génome, car elles peuvent être conditionnées dans des véhicules de distribution de petit volume tels que le virus adéno-associé désactivé (AAV). En tant que telles protéines compactes, nous pouvons utiliser des variantes Cas trouvées dans les bactériophages, par exemple CRISPR-CasΦ, qui a la moitié du poids moléculaire par rapport à Cas9 ou le CasMINI génétiquement modifié, qui, malgré sa petite taille, s’est avéré être aussi efficace dans les cellules de mammifères comme le Cas ordinaire, et en même temps pénètre mieux dans les cellules.

Modification de Cas9

La modification de Cas9 par sa fusion avec des peptides modulateurs de la chromatine dérivés des protéines du groupe à haute mobilité HMGN1 et HMGB1, de l’histone H1 et des complexes de remodelage de la chromatine augmente plusieurs fois son activité, notamment en ce qui concerne les régions de la chromatine qui lui sont réfractaires. Cette stratégie de fusion, appelée CRISPR-chrom, peut être utilisée pour améliorer l’efficacité des nucléases Cas9 dans la modification du génome.

Édition CRISPR/Cas9 avec amorce

Édition d’amorce dCas9-RT – cette méthode utilise la nucléase Cas9 (modifiée pour pouvoir créer une cassure dans un seul brin d’ADN) couplée à une transcriptase inverse (RT) et au lieu de l’ARN guide habituel, ce qu’on appelle le pegRNA ( guide d’édition principal) est utilisé ARN – avec guide d’édition d’amorce ARN). Cette méthode, selon les auteurs, est plus précise et plus polyvalente que toutes les alternatives CRISPR développées jusqu’à présent.

Utilisation de dCas9 pour l’imagerie de séquences génomiques in situ

Les chercheurs ont développé une nouvelle technique d’imagerie moléculaire utilisant l’endonucléase CRISPR/dCas9 ciblée sur l’ARN liée à une étiquette. Cette technologie a permis de marquer in situ des séquences génomiques sélectionnées dans les noyaux et les chromosomes. La méthode s’appelle RGEN-ISL. Contrairement à l’hybridation in situ classique par fluorescence, RGEN-ISL ne nécessite pas de dénaturation de l’ADN et permet donc une meilleure préservation de la structure de la chromatine. Une fonction similaire est remplie par un outil génétique appelé CRISPR-HOT (CRISPR–Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis, transgenèse organoïde indépendante de l’homologie médiée par CRISPR – Cas9) pour coder en couleur des gènes spécifiques dans les organoïdes humains.

CARTOUCHE

La technologie CARTRIDGE (Cas-Responsive Translational Regulation Integrated into Diverse Gene control) utilise les protéines Cas comme répresseurs et activateurs de traduction dans les cellules de mammifères.

Endonucléases similaires à Cas9

Cas12a

Contrairement à Cas9, qui coupe les deux brins de la molécule d’ADN au même endroit, laissant des extrémités franches, Cas12a laisse un brin plus long que l’autre, créant des extrémités collantes de 4 à 5 nucléotides de long, ce qui augmente l’efficacité des inserts génétiques et leur spécificité.

Fanzor

Fanzor est une endonucléase programmable guidée par ARN provenant d’eucaryotes, d’organismes comprenant des champignons, des plantes et des animaux. Contrairement aux protéines CRISPR, les enzymes endonucléases Fanzor sont codées dans le génome eucaryote en tant qu’éléments transposables.