Applications actuelles et perspectives futures de CRISPR-Cas9 pour le traitement du cancer du poumon

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Les répétitions palindromiques courtes regroupées régulièrement espacées et les protéines associées à CRISPR sont appelées CRISPR-Cas9. Les bactéries et les archées ont un système immunitaire adaptatif (acquis). En conséquence, le développement des meilleures protéines d’endonucléase ARN et Cas9 à régulation unique et la mise en œuvre de la méthode dans la pratique clinique aideraient au traitement de maladies d’origines diverses, y compris les cancers du poumon. Ce séminaire vise à fournir un aperçu de la technologie CRISPR-Cas9, ainsi que les applications et perspectives actuelles et potentielles de la méthode, ainsi que son mécanisme d’action dans le traitement du cancer du poumon. Cette technologie peut être utilisée pour traiter le cancer du poumon de deux manières différentes. La première approche consiste à créer un ARN dirigé unique et des protéines Cas9, puis à les distribuer aux cellules cancéreuses à l’aide de méthodes appropriées. L’ARN dirigé simple regarde directement le récepteur du facteur de croissance épidermique muté du poumon et fait une correspondance complémentaire, qui est ensuite clivé avec la protéine Cas9, ralentissant la progression du cancer. La deuxième méthode consiste à manipuler l’expression de récepteurs-ligands sur des cellules lymphocytaires immunitaires. Par exemple, si le système CRISPR-Cas9 désactive l’expression des récepteurs du cancer sur les lymphocytes, il diminue le contact entre la cellule tumorale et son ligand-récepteur, ralentissant ainsi la progression du cancer.

Voir la publication originale : Tiruneh G/Medhin, Markeshaw et al. “Current Applications and Future Perspectives of CRISPR-Cas9 for the Treatment of Lung Cancer”. Biologics : targets & therapy vol. 15 199-204. 31 May. 2021, doi:10.2147/BTT.S310312


[Introduction]

Le mot CRISPR-Cas9 fait référence aux répétitions palindromiques courtes et régulièrement espacées en cluster et aux protéines associées à CRISPR (1–5). Le système CRISPR-Cas9 est une sorte d’immunité acquise que possèdent la plupart des bactéries et archées (procaryotes) pour agir contre leurs ennemis (bactériophages) (4,6). Il s’agit d’une plate-forme d’endonucléase guidée par l’acide ribonucléique (ARN) pratique et polyvalente pour l’édition du génome spécifique à un site (1,7,8) qui peut jouer un rôle énorme dans l’application de la thérapie anticancéreuse (1). L’application de cette technologie peut être utilisé pour résoudre des mutations et introduire des gènes thérapeutiques spécifiques à un site dans des cellules humaines afin de corriger les mutations causant la maladie et d’atténuer les symptômes liés à la maladie.

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Ce système est également un outil utile pour délimiter les mécanismes moléculaires impliquant des hémopathies malignes (4). L’édition de gènes spécifiques à la séquence à l’aide de CRISPR-Cas9 est prometteuse en tant que nouvelle approche thérapeutique pour le traitement d’une variété de maladies qui manquent actuellement de traitements efficaces comme les cancers (3,9). Pour accomplir sa tâche, il a besoin de la protéine endonucléase ADN Cas9 et d’un ARN guidé unique (ARNsg) qui peuvent produire une correspondance génétique précise pour les techniques d’édition et de correction (2). Ainsi, le système a permis une manipulation facile des gènes pour la communauté scientifique en faisant de l’hybride un la séquence cible et le clivage de l’ADN double brin (10).

De plus, la technologie CRISPR-Cas9 est de plus en plus réalisable pour surmonter la résistance aux médicaments dans le traitement du cancer du sein et deviendra un outil essentiel pour la médecine personnalisée (4). Il s’agit d’une percée technologique qui facilite la capacité de changer les acides nucléiques (11) et avec une amélioration continue de la fonction, le système peut aider à développer les meilleures options de traitement pour une variété de maladies génétiques qui affectent plusieurs tissus de notre corps (12). La manipulation des gènes à l’aide du système CRISPR-Cas9 a révolutionné et facilité l’étude du travail des gènes et, surtout, ouvre le nouveau ère de mécanismes de traitement pour différentes maladies, y compris le cancer (13).

Des technologies comme celle-ci sont une méthode simple et efficace pour cibler les régions d’ADN requises (14). Ainsi, les scientifiques ont conçu deux composants principaux du système pour faciliter la détection et l’altération de la fonction des gènes un composant est une protéine Cas9 qui clivent enzymatiquement le gène souhaité et le sgRNA qui scanne et détermine wh avant que le gène d’intérêt ne soit clivé par la protéine Cas9 (3,12,15). Le système a été scientifiquement optimisé et développé pour réguler l’expression du gène, modifier et éditer le locus souhaité, ce qui en fait la technologie de choix vue par la communauté scientifique pour traiter ou modifier les mutations causant des maladies plus efficacement que jamais.

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De plus, son application est encourageante pour une thérapie génique plus vigoureuse dans les configurations cliniques (16). Sur la base de la découverte, il existe trois types principaux de système CRISPR-Cas9 (I à III) et trois types supplémentaires (IV à VI) ont été identifiés plus récemment (17). Ils sont différents au cours des processus d’immunité, d’adaptation, d’expression et d’interférence, chaque type agit dans des mécanismes distincts pour assurer la manipulation génétique. Le type I utilise un grand complexe de protéines Cas9 avec des activités hélicase et DNase distinctes, tandis que le type III utilise des protéines mystérieuses associées à des répétitions, qui forment une grande superfamille Cas9.

Une autre classification est basée sur les effecteurs de sous-unités, les complexes effecteurs multi-sous-unités étant les plus courants. Les types I, III et IV sont regroupés dans la classe 1. Les systèmes, d’autre part, qui ont un seul effecteur de sous-unité sont classés dans la classe 2 comprenant les types II, V et VI (17,18). Le type II n’utilise qu’un seul effecteur. protéine (Cas9) pour son activité nucléase et a reçu plus d’attention et a été adoptée pour l’ingénierie du génome (5,17,19). Ainsi, l’objectif de ce séminaire est d’introduire la technologie CRISPR-Cas9 et de décrire les applications actuelles et les perspectives futures du système avec ses mécanisme d’action sur le traitement du cancer du poumon.

Composants de CRISPR-Cas9, maturation et acquisition d’espacement

Le gène tracrRNA sera transcrit en tracrRNA, le gène crRNA sera transcrit en pre crRNA, et le gène Cas9 sera transcrit en ARN messager Cas9 et converti en protéine Cas9, qui seront tous post-transcrits et coupés pour former le complexe CRISPR-Cas9 mature (20). Les intégrases Cas1 et Cas2, qui sont présentes dans toutes les formes CRISPR, catalysent l’intégration de l’espaceur sur la matrice CRISPR, en particulier à l’extrémité leader de la répétition, il y aura une attaque nucléophile du 3′ OH des protoespaceurs suivie de la même pratique sur l’extrémité de l’entretoise de la répétition (21).

Stratégie de formulation et mécanisme de livraison

Stratégie de formulation

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La méthode CRISPR-Cas9 a une variété de méthodes de formulation pour l’édition du génome. L’utilisation d’un système CRISPR-Cas9 à base de plasmide codant à la fois la protéine Cas9 et l’ARNsg du même vecteur, qui est nécessaire pour éviter les transfections multiples de différents composants de la technologie, est la technique principale et peut-être la plus simple. La protéine Cas9 et le sgRNA seront exprimés dans le vecteur, qui formera le complexe sgRNA-Cas9 dans les cellules pour modifier les séquences génomiques cibles (3,12,15,18). La deuxième approche consiste à combiner l’ARNm Cas9 et le sgRNA. Le complexe sgRNA-Cas9 sera formé lorsque l’ARNm Cas9 sera converti en protéine Cas9 dans les cellules. La troisième stratégie consiste à délivrer le complexe sgRNA-Cas9 assemblé in vitro directement dans la cellule (18).

Mécanisme de livraison

Il est difficile de transmettre l’acide nucléique en général, et CRISPR-Cas9 en particulier, au tissu ou à la cellule cible. Les approches physiques et vectorielles (virales ou non virales) sont deux des stratégies de distribution les plus largement utilisées (11,22,23). L’électroporation et les microinjections sont utilisées dans les méthodes physiques, tandis que les stratégies d’administration virale telles que le virus adéno-associé (AAV) sont largement utilisées dans les méthodes vectorielles car ils ne sont pas des agents pathogènes et peuvent infecter à la fois les cellules en division et non en division25 et les lentivirus avec des enzymes intégrases inactivées sont à l’étude (24).

Une autre technique est la lipofection (transfection de nanoparticules à médiation lipidique), qui est probablement la méthode d’administration in vivo de CRISPR-Cas9 la plus efficace (22) Cette technique a été perfectionnée par26 et est actuellement testée dans le cadre d’essais cliniques (13,24).

L’application du système CRISPR-Cas9 et son mode d’action

Le système CRISPR-Cas9, tel que discuté un peu plus tôt, est composé de deux composants principaux qui travaillent ensemble pour atteindre son objectif (19). Le sgRNA contient le crRNA, qui scanne et identifie les séquences d’ADN cibles qui doivent être clivées et corrigées, et crRNA transactivé (tracrRNA), qui recrute le composant deux, l’endonucléase ADN de la protéine Cas9, qui peut détecter, identifier et établir des cassures d’ADN double brin (DSB) spécifiques au site.15 En raison de sa simplicité et de sa commodité, la bactérie CRISPR de type II -Le système Cas9 a été utilisé pour les nucléases d’ingénierie guidées par l’ARN (4,18).

Cependant, les séquences de motifs adjacents proto-espaceurs (PAM) sont requises par le procédé. Après reconnaissance, deux domaines Cas9 clivent l’ADN double brin : le domaine endonucléase nommé pour le domaine caractéristique des résidus d’histidine et d’asparagine (HNH), qui clive le brin complémentaire, et le domaine endonucléase nommé pour une protéine d’E. coli impliquée dans la réparation de l’ADN (RuvC -like), qui clive le brin non complémentaire (17). En conséquence, la machinerie de réparation de l’ADN de l’hôte introduit de nombreuses mutations telles que des substitutions, des suppressions et des insertions dans le génome cible, y compris la jonction d’extrémités non homologues (NHEJ) ou la réparation homologue dépendante (HDR) (15-18).

Un autre article, CRISPR-Cas9 for Cancer Therapy: Hopes and Challenges, soutient cette théorie en démontrant que le complexe sgRNA-Cas9 analyse et s’hybride à la séquence cible génomique avec une complémentarité d’appariement de bases et clive avec précision l’ADN double brin de la cellule cible après identification du protospacer séquence de motifs adjacents (PAM) adjacente à la séquence cible. Les voies NHEJ ou HDR sont activées à la suite de cassures double brin. NHEJ est un mécanisme de réparation sujet aux erreurs qui entraîne des indels (insertions ou suppressions) de paires de bases aléatoires perturbant la séquence cible en l’absence d’un prototype de réparation homologue avec des mécanismes de réparation plus spécifiques (23,27).

Application spécifique du système CRISPR-Cas9 pour le traitement du cancer du poumon

Le cancer du poumon est la principale cause de décès aux États-Unis et un problème de santé publique important dans le monde (5). Dans les pays développés comme dans les pays en développement, c’est une cause fréquente de morbidité et de mortalité.28 Selon une étude menée par l’American Lung Cancer Society en 2015, le cancer du poumon tue près de 150 000 personnes chaque année. Cependant, la chirurgie et la radiothérapie ont été utilisées comme options de traitement.

Le traitement a ensuite été remplacé par des inhibiteurs sélectifs de la tyrosine kinase (ITK) comme le géfitinib et l’erlotinib pour inhiber l’activité tyrosine kinase du récepteur du facteur de croissance épidermique, qui présente des difficultés techniques et une cytotoxicité non spécifique (EGFR) (29,30). Liaison de ligand extracellulaire, transmembranaire et des domaines tyrosine kinase intracellulaires se trouvent dans cette glycoprotéine membranaire. Lorsque l’activateur de ligand se lie au domaine de ligand extracellulaire, il transduit et initie des activités de kinase intracellulaire, qui provoquent une prolifération cellulaire, une néovascularisation, une invasion et des métastases, ainsi qu’une réduction de l’apoptose et de l’activation de la glycolyse. Ces médicaments, cependant, ont rencontré une résistance aux médicaments (28,29).

Le dispositif CRISPR-Cas9 marque le début d’une nouvelle ère biotechnologique et d’une technologie révolutionnaire utilisée pour traiter le cancer du poumon (6,29). Le système fonctionne de deux manières. La première consiste à concevoir un ARNsg qui recherche la séquence EGFR mutée, qui est ensuite accompagnée de la protéine Cas9. Pour ce faire, les scientifiques ont créé un dispositif CRISPR qui a des séquences complémentaires avec l’EGFR muté et l’a introduit dans le patient, comme mentionné précédemment, qui a des séquences complémentaires avec l’EGFR muté et l’a introduit dans le patient.

Comme cette séquence complémentaire se lie à l’EGFR muté, la protéine Cas9 (endonucléase) crée une cassure de l’ADN double brin ou simple brin, selon le type d’enzyme utilisé, suivie de mécanismes de réparation de l’ADN tels que la réparation de l’ADN homologue ou non homologue (29). Si la mutation du récepteur est limitée, il n’y aura pas de contact entre l’activateur du ligand, ce qui n’entraînera aucune prolifération cellulaire, néovascularisation ou métastase cancéreuse, et le problème sera résolu. L’inhibition de l’EGFR par CRISPR-Cas9 augmente l’expression du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I, ce qui améliore la reconnaissance des lymphocytes cytotoxiques et la lyse des cellules tumorales (30,31).

Les effets hors cible, qui peuvent induire une instabilité du génome, des perturbations fonctionnelles des gènes et des altérations épigénétiques, constituent un défi. Les effets hors cible des systèmes CRISPR-Cas9, en particulier lorsqu’ils sont utilisés à des fins thérapeutiques, doivent être minimisés et profilés avec précision. Les effets hors cible sont séparés en deux catégories: la liaison hors cible et le clivage hors cible. Cas9 peut se lier à des séquences cibles partiellement complémentaires au sgRNA et inhiber la transcription du gène cible sans les cliver (8). Les effets de liaison hors cible peuvent ainsi être supprimés dans les approches traditionnelles d’identification hors cible, telles que l’utilisation de sgRNA assemblé in vitro avec association durable avec cas9, qui a également une forte proportion de cible et une efficacité élevée pour l’édition du génome. Une autre technique consiste à utiliser une variante Cas9 ou Cas9 modifié qui peut générer une seule entaille sur un brin (23). Ainsi, l’effet hors cible est réduit.

La deuxième stratégie, tout aussi importante, pour utiliser cette méthode biotechnologique pour traiter le cancer du poumon consiste à rechercher des cellules immunitaires comme les lymphocytes. Les cellules T sont des cellules immunitaires extraites du sang de patients engagés dans un essai clinique pour le traitement du cancer du poumon en Chine, puis CRISPR-Cas9 est utilisé pour éliminer un gène dans les cellules qui code une protéine appelée PD-1. Les cellules génétiques modifiées seraient ensuite propagées en laboratoire avant d’être réinjectées dans la circulation sanguine du patient (6,25).

Les scientifiques ont prélevé du sang du patient et extrait les lymphocytes, qui ont ensuite été traités avec un système d’édition de gènes CRISPR-Cas9 contenant une séquence sgRNA avec un motif identique à la protéine de mort programmable 1 des lymphocytes (PD 1). Lorsque le système détecte sa séquence cible, cas9 rompt l’ADN, qui est ensuite réparé par des mécanismes de réparation cellulaire. Lorsque l’expression du gène PD 1 est bloquée ou désactivée, les cellules cancéreuses manquent du récepteur sur les lymphocytes immuns (6,25).

En conséquence, si les lymphocytes n’expriment pas bien le récepteur PD 1, il y aura moins de contact entre le ligand cancéreux et récepteur, ce qui amène le récepteur des cellules T à identifier la cellule problématique et à remplir sa fonction. Naturellement, ces lymphocytes manipulés ont été testés pour la viabilité et la lympho-prolifération afin d’exclure de nouvelles mutations, et seules les cellules qui ont réussi le test ont été renvoyées au patient (6,25). De plus, l’élimination de la protéine PD-1 sur les cellules immunitaires est nécessaire. pour l’activation des caspases, qui est nécessaire pour la mort cellulaire programmée et l’apoptose accrue dans les cellules cancéreuses (31). Il conclut également que les cellules déficientes en PD-1 ont une puissante activité antitumorale des lymphocytes cytotoxiques.

L’hyperactivité des cellules T manipulées est l’un des inconvénients de la technologie pour une utilisation de cette manière6 et l’obtention d’une méthode d’administration sûre et efficace, ainsi que certains effets secondaires. essai visant à évaluer l’innocuité du knock-out médié par CRISPR-Cas9 de la thérapie génique PD-1 chez les patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules métastatique. Neuf patients ont été inclus et huit patients ont reçu une thérapie cellulaire T déficiente en PD-1, et les patients se sont manifestés avec une thérapie cellulaire T déficiente en PD-1. sains, et les chercheurs ont recommandé que des études plus larges soient menées pour déterminer le dosage et la réponse immunitaire les plus appropriés.

Perspective d’avenir

En biologie du cancer, le dispositif CRISPR-Cas9 a un bel avenir devant lui9, car il s’agit d’une technologie adaptable, simple, pratique et efficace (32,33). La méthode introduit une nouvelle approche du traitement du cancer en permettant des modifications au génome des cellules cibles, ce qui était auparavant difficile à réaliser (34-36) la polyvalence, l’efficacité et la flexibilité de la technologie en feraient la meilleure forme de soins contre le cancer à l’avenir (4,37,38). Cela affectera la biologie du cancer en tant que ensemble à l’avenir34 et si les chercheurs ont conçu des stratégies et des instruments bien organisés pour fournir la technologie à la cellule ou au tissu cible, ainsi que des méthodes et des instructions efficaces pour contrôler et éliminer les effets hors cible de la technologie.

Conclusion

Le dispositif CRISPR-Cas9 est une percée biotechnologique et une réalisation scientifique récentes. Cette technologie a créé une nouvelle option de traitement pour des maladies d’origines diverses, telles que le cancer et les maladies infectieuses. Pour résoudre le problème, le meilleur sgRNA doit être conçu à l’aide d’un outil CRISPR (http://crispr.mit.edu) et de sa protéine endonucléase cas9 associée contre la séquence cible. Cependant, les préoccupations éthiques, la nécessité des meilleures stratégies de livraison et le risque d’effets hors cible ne sont que quelques-uns des problèmes qui doivent être résolus.

Étant donné que la technologie en est encore à ses balbutiements, les chercheurs doivent concevoir des méthodes et des mécanismes simples pour suivre et tester sa protection et son efficacité. Pour une comparaison simple, les avantages de cette technologie sont simples, rapides, relativement efficaces, relativement précis et polyvalents, tandis que les inconvénients sont que la distribution est difficile, les problèmes éthiques sont très conservateurs, certains effets hors cible et certains effets indésirables.

Abréviations

Abréviations du texte original: 1. ATP, Adenosine triphosphate; 2. CRISPR, Clustered regularly interspaced short palindromic repeat; 3. CRISPR-Cas, Clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated; 4. CrRNA, Clustered regularly interspaced short palindromic repeat ribonucleic acid; 5. DNA, Deoxyribonucleic acid; 6. DSB, Double-stranded break; 7. EGFR, epidermal growth factor receptor; 8. HDR, Homologous directed repair; mRNA, Messenger ribonucleic acid; 9. NHEJ, Non-homologous end-joining; 10. PD 1, Programmable death protein 1; 11. RNA, Ribonucleic acid; 12. SgRNA, Single guided ribonucleic acid; 13. TracrRNA, Trans activating clustered regularly short palindromic repeat ribonucleic acid; 13. TKIs, Tyrosine kinase inhibitors.

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