La détection de l’activité des outils d’édition de gènes CRISPR dans les organismes à l’œil nu et à l’aide d’une lampe de poche ultraviolette est désormais possible grâce à la technologie développée au laboratoire national d’Oak Ridge du ministère de l’Énergie des États-Unis. Les scientifiques ont fait la démonstration de ces outils de détection en temps réel chez les plantes et anticipent leur utilisation chez les animaux, les bactéries et les champignons avec diverses applications pour la biotechnologie, la biosécurité, la bioénergie et l’agriculture. L’équipe a décrit le développement réussi du système UV Horticulture Research et sa démonstration de principe dans ACS Synthetic Biology.
Les technologies CRISPR sont rapidement devenues les principaux outils de la bio-ingénierie et de nouvelles versions sont continuellement en développement. Identifier si un organisme a été modifié par la technologie CRISPR était auparavant un processus complexe et long. “Avant cela, la seule façon de savoir si l’ingénierie du génome s’était produite était de faire une analyse médico-légale”, a déclaré Paul Abraham, chimiste bioanalytique et responsable du domaine d’intérêt pour l’ingénierie des écosystèmes sécurisés et la science de la conception de l’ORNL. “Pour réussir, vous devez savoir à quoi ressemble le génome avant qu’il ne soit réécrit. Nous voulions concevoir une plate-forme où nous pourrions observer de manière proactive l’activité de CRISPR”.
L’équipe de recherche a développé une solution d’auto-détection efficace qui tire parti du fonctionnement de CRISPR pour déclencher la révélation de la technologie. Dans des conditions normales, CRISPR fonctionne en se connectant à une courte séquence d’ARN, connue sous le nom d’ARN guide, car elle conduit CRISPR à une séquence d’ADN correspondante. Lorsque l’ADN cible est trouvé, CRISPR modifie l’ADN en agissant comme de minuscules ciseaux moléculaires pour couper un ou les deux brins d’ADN, selon le type de technologie CRISPR utilisé.
Abraham compare leur méthode à un système d’alarme à deux composants: un ARN guide de biocapteur qui redirige l’activité CRISPR et une protéine rapporteur qui signale l’activité. Les chercheurs codent les deux composants dans l’ADN d’un organisme pour permettre le système de surveillance. Une fois le système d’auto-détection en place, l’ARN guide du biocapteur intercepte CRISPR, empêchant CRISPR de se connecter à son gène cible d’origine et redirigeant CRISPR vers une séquence d’ADN spécifique qui code pour une protéine fluorescente verte non fonctionnelle, ou GFP. Lorsque CRISPR modifie la séquence, il actionne un interrupteur qui produit une GFP fonctionnelle, ce qui crée une lueur verte signalant la présence de CRISPR.
Parce qu’un microscope est nécessaire pour voir la lueur de la GFP, les chercheurs ont amélioré leur méthode originale en remplaçant la GFP par une protéine rapporteur similaire, appelée eYGFPuv, qui est visible sous le type de lumière ultraviolette communément appelée lumière noire.
Le système de biocapteurs de l’ORNL révèle l’activité CRISPR dans les plantules de peuplier, qui brillent d’un vert vif sous la lumière ultraviolette, par rapport aux plantes normales, qui apparaissent en rouge. Crédit: © Guoliang Yuan/ORNL, U.S. Dept. of Energy.
“Maintenant, nous pouvons voir si CRISPR est actif en temps réel indépendamment de la taille, de la forme et de l’emplacement des organismes que nous évaluons”, a déclaré Abraham. “Cette flexibilité accélère le processus de bio-ingénierie et étend l’utilisation des biocapteurs dans les applications de laboratoire et de terrain”. Étant donné que CRISPR doit être adapté à chaque organisme pour une utilisation efficace, savoir si la technologie CRISPR fonctionne dans une plante ou un microbe particulier peut accélérer les progrès vers des objectifs tels que le développement de cultures bioénergétiques résistantes à la sécheresse et de bactéries d’ingénierie pour convertir efficacement les plantes en carburants d’aviation durables.
“Ces outils nous permettent d’identifier rapidement les transformants positifs avec les changements génétiques souhaités que nous ciblons”, a déclaré Carrie Eckert, responsable du groupe de biologie synthétique de l’ORNL. “Nous sommes facilement en mesure de voir les variantes par rapport à celles pour lesquelles aucune modification n’a eu lieu”. Les biocapteurs fournissent également une méthode efficace pour savoir si CRISPR est toujours actif après que les modifications souhaitées ont pris effet. Xiaohan Yang, biologiste de synthèse végétale et co-auteur de l’ORNL, compare l’activité d’édition du génome de CRISPR à une chirurgie bénéfique, mais prévient que “vous ne voulez pas que le chirurgien laisse les ciseaux derrière lui”, car l’activité continue de CRISPR pourrait avoir des effets inattendus.
Yang envisage des applications de biocapteurs qui pourraient tester la descendance de plantes modifiées, par exemple, pour vérifier que la machinerie d’édition de gènes ne leur a pas été transférée. Avec cette technologie, il est possible de surveiller un champ entier de cultures. L’équipe de recherche a créé des biocapteurs spécifiques pour détecter divers outils CRISPR, notamment la nucléase Cas9, l’éditeur principal, l’éditeur de base et CRISPRa. Ils ont fait la démonstration des capteurs individuellement, chaque capteur signalant la présence d’un type particulier d’outil CRISPR. Abraham voit également le potentiel de combiner les biocapteurs dans une version qui signalerait plusieurs technologies d’édition de gènes à la fois. “Nous continuerons à optimiser ces biocapteurs pour améliorer la sécurité des biotechnologies de prochaine génération”, a déclaré Abraham.
Les contributeurs à l’article intitulé “Élargir l’application d’un reporter UV-visible pour les expressions génétiques transitoires et la transformation stable des plantes” incluent Guoliang Yuan, Haiwei Lu, Md. Mahmudul Hassan, Jin-Gui Chen, Gerald Tuskan et Xiaohan Yang, de l’ORNL. ainsi que Dan Tang et Yi Li de l’Université du Connecticut. Les scientifiques ont détaillé leur démonstration de preuve de principe dans ACS Synthetic Biology. Les co-auteurs de l’article, «Biocapteurs à base de plantes pour la détection de l’édition du génome médiée par CRISPR», incluent Guoliang Yuan de l’ORNL, Md. Mahmudul Hassan, Tao Yao, Haiwei Lu, Michael Vergara, Wellington Muchero, Jin-Gui Chen, Gerald Tuskan , Paul Abraham, Xiaohan Yang et Jesse Labbe (maintenant à Invaio Sciences), ainsi que Changtian Pan et Yiping Qi de l’Université du Maryland.
Voir les publications
1. Yuan, G., Lu, H., Tang, D. et al. Expanding the application of a UV-visible reporter for transient gene expression and stable transformation in plants. Hortic Res 8, 234 (2021). https://doi.org/10.1038/s41438-021-00663-3
2. Guoliang Yuan, Md. Mahmudul Hassan, Tao Yao, Haiwei Lu, Michael Melesse Vergara, Jesse L. Labbé, Wellington Muchero, Changtian Pan, Jin-Gui Chen, Gerald A. Tuskan, Yiping Qi, Paul E. Abraham, and Xiaohan Yang. “Plant-Based Biosensors for Detecting CRISPR-Mediated Genome Engineering”, ACS Synthetic Biology, 2021, DOI: 10.1021/acssynbio.1c00455