Progrès récents dans la compréhension des types de cellules pendant la gastrulation humaine

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La gastrulation est un processus fondamental au cours du développement embryonnaire, conservé chez tous les animaux multicellulaires. Chez la majorité des métazoaires, la gastrulation est caractérisée par un remodelage morphogénétique à grande échelle, conduisant à la conversion d’une couche de cellules embryonnaires pluripotentes précoces en trois «couches germinales» primaires: un ectoderme externe, un endoderme interne et une couche de mésoderme intermédiaire. La morphogenèse de ces trois couches de cellules est étroitement coordonnée avec la diversification cellulaire, jetant les bases de la génération de centaines de types cellulaires spécialisés distincts dans le corps animal. Le processus de gastrulation a pendant longtemps attiré une attention considérable dans un large éventail de systèmes expérimentaux allant des éponges aux souris. Chez l’homme, le processus de gastrulation commence environ 14 jours après la fécondation et se poursuit pendant un peu plus d’une semaine. Cependant, notre compréhension de ce processus important, en ce qui concerne l’homme, est limitée. Les dons de matériel fœtal humain à ces premiers stades sont exceptionnellement rares, ce qui rend presque impossible l’étude directe de la gastrulation humaine. Par conséquent, notre compréhension de la gastrulation humaine est principalement dérivée de modèles animaux tels que la souris et d’études de collections limitées d’échantillons entiers fixes et de coupes histologiques de gastrules humaines, dont certaines remontent à plus d’un siècle. Plus récemment, nous avons acquis des connaissances moléculaires précieuses sur la gastrulation humaine en utilisant des modèles in vitro de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et, de plus en plus, des embryons de primates humains et non humains cultivés in vitro. Cependant, alors que des méthodes ont été développées pour cultiver des embryons humains à ce stade (et probablement au-delà), les normes éthiques actuelles interdisent la culture d’embryons humains au-delà de 14 jours, limitant à nouveau notre capacité à sonder expérimentalement la gastrulation humaine. Cette revue traite des connaissances moléculaires récentes de l’étude d’une gastrula humaine au stade 7 de Carnegie  (CS7) obtenue (ce qui est rare, vue les limites éthiques et justifiables, de la recherche sur les embryons humains).


Introduction

Historiquement, la compréhension de la gastrulation humaine s’est appuyée sur l’examen morphologique d’embryons humains fixés dans des collections telles que les collections Carnegie, Kyoto ou Blechschmidt. La collection Carnegie est l’une des plus anciennes et des mieux caractérisées. Il a été utilisé pour établir le système de stadification standardisé éponyme du développement humain. La collection a été créée en 1887 par Franklin Mall, formé par Wilhelm His à l’Université de Leipzig en 1884. Wilhelm His a été le premier à écrire des descriptions comparatives d’embryons humains à la fin des années 1800. Au retour de Franklin Mall en Amérique, il commença à collecter des embryons humains et, en 1914, reçut 15 000 dollars (l’équivalent d’environ 400 000 dollars aujourd’hui) du Carnegie Institute for Science pour commencer à caractériser de manière scientifique la croissance normale et anormale des embryons. Ce travail a été initié au nouveau département d’embryologie de la Carnegie Institution of Washington à Baltimore, où Mall avait été nommé directeur. Au cours des cinquante années suivantes, la collection s’est élargie pour enregistrer plus de 10 000 embryons, qui ont servi de base à des centaines d’articles de recherche et continuent d’être un référentiel précieux.

Bien que les embryons de cette collection se soient avérés inestimables pour les études sur le développement humain, nous devons reconnaître que bon nombre des échantillons à un stade précoce ont été collectés en utilisant des pratiques qui seraient considérées comme laxistes par les normes éthiques actuelles relatives à la recherche humaine. Les embryons de la collection Carnegie étaient généralement prélevés par hystérectomie sur des femmes enceintes qui n’étaient pas nécessairement correctement informées de l’utilisation potentielle des tissus et des échantillons obtenus au cours de la chirurgie. Les tests de grossesse n’existaient pas à l’époque, et alors qu’aujourd’hui, il serait considéré comme contraire à l’éthique d’opérer une femme enceinte, cela s’est produit à plusieurs reprises jusqu’aux années 1950.

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La plus grande collection d’embryons humains est la collection de Kyoto, initiée par le professeur Hideo Nishimura au Département d’anatomie de l’Université de Kyoto vers 1961. Les deux principaux facteurs qui ont conduit à l’initiation de cette collecte étaient le nombre limité d’échantillons fiables collectés à partir d’avortements spontanés chez les mères présentant des conditions pathologiques, et la révision de la loi japonaise sur la protection eugénique en 1952, qui permettait aux gynécologues qualifiés d’interrompre une grossesse pour des raisons sociomédicales, entraînant une augmentation du nombre d’interruptions sociales de grossesse. Cela signifiait que la collecte pouvait être effectuée en coopération avec des obstétriciens et 34 270 embryons et 3 852 fœtus ont été collectés de 1962 à 1974. La collection s’est depuis étendue à plus de 44 000 spécimens humains. La collection de Kyoto contient principalement des embryons humains à des stades avancés de développement, caractérisant à la fois le développement normal et anormal.

En termes de gastrulation contrairement à la collection Carnegie, la collection de Kyoto ne contient que des embryons humains du Stade 7 de Carnegie 7 (CS7), c’est-à-dire après l’initiation de la gastrulation, et possède relativement peu d’échantillons couvrant les stades de gastrulation (30 embryons gastrulants sur 23 810 spécimens à la date 2014). La rareté des embryons humains gastrulants est également mise en évidence dans la principale collection de recherche de la Carnegie Collection, appelée «Yellow Files», qui contient 84 embryons pré-gastrualnts et gastrulants (CS 2–9) contre 555 embryons post-gastrulants. Le nombre relativement limité d’embryons gastrulants dans les deux collections reflète le stade précoce auquel se produit la gastrulation humaine (entre environ 14 et 21 jours après la conception), car il est peu probable que la majorité des femmes sachent qu’elles sont enceintes à ce stade.

Les échantillons de ces collections sont tous fixes et nombre d’entre eux ne sont disponibles que sous forme de sections. Pour rendre ces précieux échantillons plus facilement accessibles au public, des collections en ligne telles que le Digital Embryology Consortium et le Virtual Human Embryo Project ont travaillé à la numérisation des principales collections histologiques d’embryologie. Des technologies d’imagerie modernes et non destructives, telles que l’imagerie par résonance magnétique (IRM), la tomographie par micro-ordinateur (micro-CT) et la tomographie par projection optique (OPT), ont été utilisées pour générer des modèles 3D d’embryons humains aux stades post-gastrulation sur la base de ces échantillons historiques.

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Plus récemment, la création de la Human Developmental Biology Resource (HDBR) au Royaume-Uni a grandement facilité la recherche fondamentale sur tous les aspects du développement humain. Le HDBR est une ressource vitale qui fournit aux chercheurs des tissus embryonnaires et fœtaux frais et fixes, conformément aux directives éthiques énoncées dans le rapport Polkinghorne (Review of the Guidance on the Research Use of Fetus and Fetal Material, 1989). La microscopie épiscopique à haute résolution (HREM) a été appliquée aux embryons humains collectés via le HDBR, pour générer des images haute résolution de coupes en série d’embryons humains. Ces données HREM ont été utilisées pour générer des modèles 3D haute résolution qui capturent de grands détails morphologiques. Cependant, encore une fois en raison du manque de disponibilité et de taille, cette approche n’a été appliquée aux embryons de stade 12/13 de Carnegie qu’une fois la gastrulation terminée. Par conséquent, nous sommes limités dans notre compréhension de la morphologie des embryons humains gastrulants aux sections historiques de la gastrula humaine rapportées dans des études fondamentales telles que celles de Hertig et ses collègues.

Stadification du début de la gastrulation

Figure 1 – Stadification de la gastrulation humaine. A : Échelle de temps du développement humain précoce mettant en évidence les étapes de Carnegie et les événements clés de cette période. B : Diagramme schématique montrant un embryon humain aux alentours du stade Carnegie 6b au début de la gastrulation. C : Graphique montrant le début de la formation de stries primitives et la progression de leur taille au cours des stades Carnegie 6 à 8 — (ED : disque embryonnaire ; PS : Série primitive) — Adapté de O’Rahilly 1973.

Afin d’évaluer avec précision le développement humain et de faire des comparaisons avec d’autres organismes modèles, un système de stadification normalisé est nécessaire. En 1942, George Streeter, utilisant des échantillons de la collection Carnegie, a publié ses Developmental Horizons in Human Embryos qui décrivaient les critères de stade de développement précoce. Les horizons de développement de Streeter représentaient 12 étapes du développement de l’embryon humain et sont devenus la base du système de Stadification de Carnegie (Carnegie Staging ou CS). La description du CS1–9, couvrant la gastrulation, a été publiée pour la première fois en 1973 (Fig. 1a). Avant 1973, deux systèmes de stadification alternatifs étaient proposés, tous deux avaient des avantages et des inconvénients, mais ne se sont finalement pas établis et la stadification unifiée de Carnegie est maintenant le système le plus largement utilisé.

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Au moment où ce système de stadification a été établi, en l’absence de marqueurs génétiques, la gastrulation a été définie sur la base de la morphologie, par la formation d’une strie primitive, la structure médiane à travers laquelle les cellules de l’épiblaste se délaminent pour former l’endoderme et le mésoderme. La strie primitive commence à se former à la future extrémité caudale du disque embryonnaire et s’allonge pour occuper environ la moitié de la longueur du disque, avec une caractéristique en forme de fosse, le nœud, à l’extrémité rostrale de la strie (Figures. 1b et 2). Le nœud agit comme un organisateur de l’axe principal du corps et établit des asymétries axiales gauche-droite au cours du développement (Fig. 2). Une fois qu’il a atteint cette longueur maximale, la strie commence à régresser vers l’extrémité caudale du disque embryonnaire. Pendant que cela se produit, les cellules se délaminent continuellement à travers la strie pour former l’endoderme et le mésoderme.

Figure 2 – Gastrula humaine de Stade 7 de Carnegie (CS 7).  A : Schéma montrant une vue latérale d’un embryon humain au stade 7 de Carnegie. Diagrammes schématiques du disque embryonnaire disséqué montrant la strie primitive et le nœud d’une vue dorsale (B) et ventrale (C). D : Image de l’embryon humain CS7 à l’échelle avec une règle de 1 cm. E : Images d’un embryon humain au stade 7 de Carnegie. Panneau de gauche, vue latérale d’un embryon intact ; panneau du milieu, vue dorsale du disque embryonnaire ; panneau de droite, vue ventrale du disque embryonnaire (barre d’échelle = 500 µm).

La gastrulation chez l’homme s’initie au stade 6 de Carnegie, stade en partie défini en fonction de la taille de l’embryon, avec un disque embryonnaire typiquement compris entre 0,15 et 0,45 mm le long de l’axe rostral-caudal et avec un diamètre du chorion allant de 1 à 4,5 mm (Fig. 1c). Les embryons évalués à ce stade ont été définis en fonction de la présence de villosités chorioniques ainsi que de caractéristiques axiales telles qu’une strie primitive. Sur cette base, stade 6 de Carnegie a été divisé en deux sous-étapes, stade 6a de Carnegie et stade 6b de Carnegie, cette dernière correspondant à la présence visible d’une séquence primitive. Au stade 6 de Carnegie, les trois espaces extra-embryonnaires ; la cavité amniotique, le sac vitellin primitif et la cavité chorionique sont présents. Dans les embryons stade 6b de Carnegie, la strie primitive est clairement définie et sa longueur varie de 0,021 mm (embryon Liverpool I) à 0,187 mm (HEB 18) à partir du bord caudal du disque embryonnaire.

Historiquement, la présence d’une séquence primitive était définie par les critères de Brewer. Ces critères inclus; prolifération active des cellules, perte de la membrane basale séparant l’épiblaste et l’endoderme, migration des cellules de l’épiblaste et mélange des cellules de l’épiblaste et du disque de l’endoderme. Cependant, la forme sous laquelle la séquence primitive humaine se manifeste n’est pas claire et, par conséquent, il y a eu un débat sur la question de savoir si certains spécimens contiennent ou non une ligne primitive. Cela a conduit à l’évaluation de certains embryons au stade 6a de Carnegie comme ayant une séquence primitive et à certains embryons de stade 6b de Carnegie décrits comme n’ayant pas de PS. Par exemple, Brewer a décrit la strie primitive comme un croissant de cellules à la marge caudale du disque embryonnaire d’un échantillon au stade 6b de Carnegie. Cependant, cela a été contesté dans une étude de suivi du même spécimen. Chez le poussin, la formation du PS est induite par une région appelée faucille de Koller, qui est un épaississement en forme de croissant de cellules à la limite caudale de l’épiblaste. La strie précoce prend alors la forme d’une structure triangulaire dans la même région avant de s’allonger vers le milieu du disque. Ces caractéristiques précoces seraient difficiles à détecter sur la base de la seule morphologie dans des échantillons humains et même dans des systèmes modèles, sont plus facilement détectées à des stades naissants basés sur l’expression de gènes tels que Brachyury, qui marque la séquence chez la souris et le poussin. On pourrait spéculer que ce que Brewer a décrit comme une ligne primitive croissant pourrait être l’équivalent chez l’homme de la faucille du poussin Koller, ce qui placerait ce spécimen au stade 6b de Carnegie légèrement avant la formation de stries. Cependant, il est important de noter que le lapin, qui a également un embryon de disque bilaminaire avant la gastrulation, ne présente pas une structure similaire à la faucille de Koller.

Dans certains jeunes échantillons de stade 6b de Carnegie, la ligne primitive a été décrite comme prenant la forme d’un nœud, situé au milieu du disque embryonnaire. Cela a conduit à un débat sur la question de savoir si les caractéristiques axiales de ces échantillons représentent le nœud et non la ligne primitive comme discuté par O’Rahilly. Une interprétation était que chez l’homme, le nœud primitif se forme avant la formation de stries, bien que cela ne soit probablement pas le cas, car chez la souris et le poussin, le nœud se forme après la ligne primitive. La présence d’une structure en forme de nœud reconnue dans ces spécimens de stade 6b de Carnegie indiquait très probablement qu’une ligne primitive s’était déjà formé, bien qu’il ne puisse pas être détecté visuellement. En résumé, ces discussions mettent en évidence la difficulté de mettre en scène avec précision le début de la gastrulation chez l’homme étant donné les échantillons historiques limités disponibles à ce stade de développement et parlent de la nécessité d’une caractérisation détaillée dans plusieurs autres systèmes modèles.

Analyse transcriptionnelle de la gastrulation humaine

Récemment, nous avons eu la chance de recevoir un embryon humain en cours de gastrulation. Compte tenu des caractéristiques morphologiques clairement visibles, telles qu’un nœud, une strie primitive étendue et une plaque préchordale, nous avons pu mettre en scène cet embryon comme stade 7 de Carnegie. Contrairement aux spécimens historiques discutés ci-dessus qui ont été analysés après la fixation, nous avons pu évaluer les dimensions d’un spécimen frais, non fixé. L’envergure de l’embryon complet de l’amnios au sac vitellin définitif était de 1,66 mm. Le disque embryonnaire s’étendait sur 1,35 mm du bord rostral au bord caudal et mesurait 0,98 mm de large, tandis que la strie primitive mesurait 0,67 mm de long (Fig. 2). Sur la base de spécimens fixes de la collection Carnegie, O’Rahilly a conclu que le disque embryonnaire au CS 7 mesurait généralement entre 0,3 et 0,7 mm de long le long de l’axe rostral à caudal, mais pouvait s’étendre jusqu’à 1 mm. La strie primitive a été enregistrée entre 0,1 et 0,37 mm occupant environ 50% de la longueur du disque embryonnaire à partir du bord caudal du disque embryonnaire. Les dimensions de notre spécimen étaient un peu plus grandes que celles des échantillons précédemment décrits, ce qui pourrait être dû au fait que les échantillons historiques ont subi un rétrécissement qui peut survenir lors de la fixation en fonction du fixateur utilisé. Compte tenu de la gamme de tailles décrites historiquement, d’autres spécimens non fixés seront nécessaires pour déterminer si ces différences reflètent une variation biologique ou sont techniques.

Au cours de la dernière décennie, il y a eu une augmentation rapide de la capacité à caractériser des cellules individuelles à la fois au niveau transcriptomique et anatomique. Il existe maintenant de grands ensembles de données transcriptomiques unicellulaires couvrant le développement précoce de l’embryon à haute résolution temporelle chez plusieurs espèces modèles, notamment le poisson zèbre, le xénope, la souris et les primates non humains. Cela a permis la caractérisation des types de progéniteurs basés sur des milliers de gènes ainsi que la dynamique temporelle de l’expression des gènes au cours du développement. Étant donné que l’échantillon que nous avons reçu était frais, nous en avons profité pour effectuer une caractérisation transcriptionnelle unicellulaire de la gastrula, ce qui nous a permis de définir les types de cellules présentes et d’étudier la dynamique de l’expression des gènes lors de la gastrulation humaine.

Similitudes et différences spécifiques aux espèces

Au cours de la gastrulation chez la souris et d’autres espèces modèles, les cellules épithéliales de l’épiblaste subissent une transformation épithéliale en mésenchymateuse (EMT) en régulant négativement les molécules de jonction adhérentes telles que la E-Cadhérine (CDH1) afin qu’elles puissent se délaminer de l’épiblaste et migrer en tant que cellules mésenchymateuses. Bien que des études utilisant des modèles de différenciation in vitro aient identifié des processus similaires se produisant dans des lignées cellulaires humaines, historiquement, il a été impossible d’examiner ce processus in vivo. Nous avons utilisé l’échantillon humain CS 7 pour comparer les cellules subissant activement la gastrulation in vivo entre les espèces. Étant donné que la souris est le principal modèle d’étude de la gastrulation des mammifères, nous avons examiné et comparé les modifications transcriptionnelles qui se produisent pendant la gastrulation chez l’homme et la souris.

Nous avons observé de nombreuses similitudes dans les modifications transcriptionnelles, telles qu’une diminution de CDH1 lors de la transition de l’épiblaste au mésoderme naissant, l’expression transitoire de TBXT et l’augmentation de SNAI1 lors de la formation du mésoderme naissant. Cependant, il y avait aussi quelques différences notables. Un exemple était dans l’expression du facteur de transcription à doigt de zinc SNAI2 (Slug), un régulateur de l’EMT. Les niveaux de SNAI2 ont augmenté de façon spectaculaire au cours de la formation naissante du mésoderme chez l’homme. Cependant, SNAI2 n’a pas été détecté lors de cette transition chez la souris. L’absence d’exigence de SNAI2 pendant la gastrulation de la souris est cohérente avec la viabilité des souris nulles SNAI2. En revanche, chez le poussin, comme chez l’homme, SNAI2 est exprimé au sein de la ligne primitive et interférer dans son expression entraîne l’émergence altérée du mésoderme de la ligne primitive. Ensemble, cela suggère que, contrairement à la souris, chez l’homme, SNAI2 peut jouer un rôle dans la régulation de l’EMT pendant la gastrulation.

En plus des différences dans les principaux facteurs de transcription, nous avons également détecté des différences dans les molécules de signalisation. Chez la souris, l’expression de diverses molécules de signalisation est cruciale pour l’EMT, la spécification de la couche germinale et la migration. TDGF1, un co-récepteur NODAL essentiel à la structuration mésodermique normale, montre une augmentation de l’expression au cours de la formation de stries primitives et de mésodermes naissants chez la souris. En revanche, dans la gastrula humaine, l’expression de TDGF1 a montré la tendance opposée, diminuant à mesure que le mésoderme naissant se formait. Le FGF8 est le seul FGF connu directement requis pour la gastrulation chez la souris, jouant un rôle particulièrement important dans la migration des cellules loin de la ligne primitive. En revanche, le FGF8 était complètement absent lors de la transition d’Epiblast à Nascent Mesoderm chez l’homme. Cependant, d’autres membres du FGF sont exprimés au cours de cette transition, notamment le FGF4 (qui est également exprimé chez la souris) et le FGF2, qui n’est pas exprimé ou requis pour la gastrulation chez la souris. Il est intéressant de noter que le traitement d’épiblastes de souris cultivés in vitro avec FGF2 a entraîné une modification du destin de ces cellules de l’ectoderme au mésoderme, indiquant un degré de redondance de fonction entre ces FGF.

Ensemble, cette comparaison indique qu’il existe une large conservation de plusieurs acteurs moléculaires dans la gastrulation humaine et murine, tels que l’implication de la famille SNAIL/SLUG de répresseurs transcriptionnels et l’influence de l’EMT dépendant de FGF/MEK. Cependant, les membres spécifiques de ces familles varient entre les humains et les souris, il sera donc intéressant d’examiner la raison sous-jacente de ces différences.

L’une des raisons de ces différences pourrait être liée aux différences d’espèces dans la morphologie des embryons. La gastrula humaine et celle du poussin se développent sous la forme d’un disque, les cellules du mésoderme émergeant à travers la strie dans la partie caudale de l’embryon et migrant dans une direction rostrale. En revanche, l’embryon de souris est de forme cylindrique, les cellules du mésoderme migrant le long des côtés latéraux de ce cylindre (Fig. 3a). Des expériences détaillées de cartographie du destin chez le poussin et la souris montrent que malgré leurs formes différentes et les chemins que les cellules mésodermiques migrantes doivent emprunter pour atteindre leur destination, le sort des cellules émergeant de différentes positions rostro-caudales le long de la strie est globalement similaire chez les deux espèces. Une telle différence dans la forme de l’embryon pourrait être la raison pour laquelle il existe également des différences dans l’expression de molécules susceptibles de jouer un rôle dans la coordination de la migration cellulaire. On pourrait supposer que, en particulier dans le cas des molécules de signalisation sécrétées, les différents membres de la famille exprimés pourraient avoir, par exemple, des propriétés de diffusion différentes adaptées à la morphologie spécifique de l’embryon, entraînant des résultats équivalents malgré les différences de morphologie globale.

Figure 3 – Différences morphologiques entre l’homme et la souris : A. Vue sagittale médiane d’un embryon humain (CS 6b/7) et de souris (E 7.0) au début de la gastrulation mettant en évidence les différences morphologiques ainsi que les types de tissus correspondants. Chez l’homme, l’endoderme adjacent à l’épiblaste est l’hypoblaste mais s’étend jusqu’à tapisser le sac vitellin secondaire extra-embryonnaire. Chez la souris, l’endoderme entourant le cylindre d’œuf est appelé endoderme viscéral mais s’étend jusqu’à tapisser le trophoblaste et est appelé endoderme pariétal. B : Diagrammes schématiques mettant en évidence les différences de taille des embryons humains et de souris à des stades de développement comparables. Les lignes pointillées représentent la migration du mésoderme, qui, en raison de sa taille et de sa morphologie, est plus poussée chez l’homme que chez la souris.

De plus, les différences de géométrie et de taille de l’embryon pourraient influencer les gradients de signalisation subis par les cellules de l’embryon. Par exemple, l’embryon de souris au stade précoce du pli de la tête (EPHF) est cylindrique et, à la limite embryonnaire-extraembryonnaire, d’environ 330 à 400 µm de large, entre les extrêmes rostral et caudal. Chez l’homme à un stade équivalent, l’embryon est un disque et s’étend sur environ 1350 µm du bord rostral au bord caudal de l’embryon, mettant en évidence la distance accrue sur laquelle les signaux diffusibles pourraient avoir à agir (Fig. 3b). En outre, compte tenu de la forme cylindrique de l’embryon de souris à ces stades, la partie de la strie la plus proche de la région de formation cardiaque rostrale est l’extrémité proximale (caudale) de la strie. En revanche, dans le disque embryonnaire humain, c’est l’extrémité rostrale de la strie qui est la plus proche du croissant cardiaque. Les différences de morphologie pourraient également affecter les forces ressenties lorsque les cellules émergent à travers la séquence primitive. Chez le poussin, qui forme également un disque comme l’humain, un anneau de traction se forme à la marge entre les régions embryonnaires et extra-embryonnaires, ce qui génère des forces qui peuvent entraîner les mouvements «polonaises» de type vortex qui accompagnent la formation de stries primitives. Compte tenu de la nature cylindrique de l’embryon de souris, il est possible que la distribution des forces mécaniques générées lors de la formation de stries primitives soit différente, ce qui entraîne la délamination des cellules dans la strie de souris soumise à un milieu de signalisation mécanique et chimique différent.

Trajectoires de développement pendant la gastrulation humaine

La lignée cellulaire reflète l’histoire du développement d’un tissu particulier, caractérisant l’ascendance cellulaire du progéniteur au type de cellule mature. Dans les systèmes modèles, cette histoire de développement a été, à des degrés divers, raisonnablement bien caractérisée. Par exemple, chez C. elegans, la lignée de toutes les cellules a été cartographiée, facilitée par le nombre relativement faible de cellules (959 chez l’hermaphrodite adulte), le développement déterminé et le corps transparent permettant d’observer la dynamique cellulaire.

Cependant, la relation linéaire entre les principaux types de cellules dans l’embryon humain reste incertaine. L’examen de l’ascendance cellulaire chez l’homme est important compte tenu des différences spécifiques à l’espèce dans la formation de certains types de cellules clés. Un exemple de ceci est le mésoderme extra-embryonnaire qui est intéressant étant donné qu’il est la source de sang primitif dans l’embryon en développement. Chez la souris, le mésoderme extraembryonnaire n’est observé qu’après le début de la gastrulation et est dérivé de cellules épiblastiques qui se sont délaminées à travers la strie primitive caudale aux stades précoce à moyen de la strie.

Chez les humains et les embryons de primates non humains, le mésoderme extraembryonnaire peut déjà être détecté autour du stade 5 de Carnegie (~ jour 11), avant la formation de stries primitives. Ce tissu a été décrit comme formant un “maillage fin et lâche” qui remplit l’espace entre la membrane exocoelomique et la face interne du trophoblaste. L’apparition du mésoderme extraembryonnaire avant le début de la gastrulation suggère une contribution non striée et potentiellement non épiblastique au mésoderme extraembryonnaire chez l’homme. Bien qu’il existe des preuves indiquant que chez les primates, le mésoderme extra-embryonnaire pourrait avoir une contribution de l’hypoblaste de l’embryon au stade du disque bilaminaire, l’origine précise des cellules vues avant la strie primitive reste incertaine, tout comme la contribution relative à le mésoderme extraembryonnaire des cellules émergeant à travers la strie pendant la gastrulation.

Notre récente analyse transcriptomique d’une seule cellule d’un embryon CS 7 a montré que le mésoderme extra-embryonnaire (prélevé principalement à partir du sac vitellin) était transcriptionnellement distinct du mésoderme embryonnaire. La cartographie de diffusion, qui ordonne les cellules en fonction de leur état de transcription, a montré une trajectoire continue de l’épiblaste au mésoderme dérivé de l’embryon le plus avancé, le «mésoderme avancé». Cette trajectoire reflétait probablement l’étendue de leur différenciation et «l’âge» des cellules, en fonction de la date à laquelle elles avaient émergé de l’épiblaste dans le passé de cet échantillon. Fait intéressant, cette trajectoire n’était pas continue avec la population de mésoderme extraembryonnaire, ce qui suggère que le mésoderme extraembryonnaire n’est peut-être pas aussi étroitement lié que les autres populations de mésoderme.

De telles différences entre la souris et l’homme soulignent la nécessité de mieux comprendre la relation clonale entre les types de cellules chez l’homme. Traditionnellement, l’analyse de la lignée chez les espèces modèles s’est appuyée sur des étiquettes de lignée génétique pour étiqueter les cellules individuelles et leurs descendants. Ces étiquettes génétiques varient de LacZ et de reporters fluorescents à des approches plus récentes telles que les cicatrices génétiques basées sur CRISPR et les codes-barres ADN. Cependant, ces approches nécessitent du génie génétique et ne peuvent pas être appliquées à des tissus humains in vivo. Par conséquent, des approches ont été développées qui utilisent des mutations somatiques ou des variations de l’ADN mitochondrial pour reconstruire la lignée cellulaire. L’utilisation de mutations somatiques pour reconstruire des relations linéaires a récemment fourni des données soutenant une origine dérivée de l’hypoblaste pour le mésoderme extra-embryonnaire. Bien que cette étude analyse un seul embryon Carnegie Stage 23 (8 semaines après la conception), elle met en évidence les applications passionnantes des technologies de séquençage à des questions importantes de la biologie du développement humain. Au fur et à mesure que ces technologies se répandront et que des échantillons humains approuvés sur le plan éthique deviendront disponibles, notre compréhension du développement humain augmentera rapidement.

L’importance et les limites des gènes «marqueurs»

Pour annoter avec précision les ensembles de données transcriptionnelles et comprendre la dynamique du développement, nous nous appuyons sur une connaissance préalable de l’expression spécifique au type cellulaire des gènes marqueurs. Il s’agit d’un défi particulier chez l’homme lorsque les échantillons sont limités, ce qui augmente notre dépendance à l’égard des profils d’expression de systèmes modèles tels que la souris. Ce défi est encore plus aigu lors de l’étude de la gastrulation, compte tenu de la nature dynamique du processus et des changements rapides dans l’expression des gènes au cours de la différenciation et de la maturation. Bien que nous ayons pu détecter certaines différences d’expression interspécifiques, nous avons globalement constaté que les marqueurs moléculaires étaient conservés entre l’homme et des espèces telles que la souris et les primates non humains.

Lors de l’utilisation de marqueurs pour annoter les types de cellules dans les études transcriptomiques, il est important de ne pas confondre l’état cellulaire avec le destin cellulaire. La technologie transcriptomique actuelle capture un arrêt sur image de l’état transcriptionnel des cellules au moment où l’échantillon a été prélevé. Cet instantané est évidemment une vue limitée d’un paysage transcriptionnel dynamique et changeant le long duquel les cellules progénitrices voyagent au fur et à mesure qu’elles sont spécifiées, puis s’engagent dans un destin particulier. Alors que les progéniteurs destinés à se différencier en un type cellulaire particulier peuvent commencer à exprimer des marqueurs de ce type cellulaire, cela n’est généralement pas suffisant pour les engager de manière irréversible dans ce destin. C’est particulièrement le cas au début de la gastrula, compte tenu de l’activité migratoire cellulaire étendue et des preuves issues d’expériences de transplantation hétérotopique de la plasticité des progéniteurs mésodermiques. Dans le cas d’études transcriptomiques dans des organismes modèles tels que la souris, on peut généralement utiliser des approches expérimentales pour marquer les cellules de lignée appartenant à des grappes transcriptionnelles spécifiques afin de déterminer leur sort, ce qui n’est pas une option dans les études sur les embryons humains précoces.

Les algorithmes utilisés pour le regroupement hiérarchique impartial des cellules en fonction de leur transcriptome reposent généralement sur des différences dans l’expression de centaines de gènes très variables dans l’ensemble de données. Lors de l’annotation des clusters, nous ne pouvons par force considérer que le sous-ensemble de ces gènes qui ont été caractérisés comme des «marqueurs» dans la littérature, ce qui peut conduire à ce que les gènes marqueurs prennent une vie propre, au détriment d’une annotation précise. L’expression variable de gènes marqueurs spécifiques au sein des clusters de transcription peut également rendre difficile l’identification du type de cellule et conduire à des conclusions trop simplifiées. Cela a été mis en évidence dans les cellules mésodermiques de la gastrula CS 7, qui exprimaient un mélange de «marqueurs» de sous-types mésodermiques spécifiques. En explorant la co-expression des signatures de marqueurs dans des cellules individuelles, nous avons pu déterminer que les marqueurs des sous-types mésodermiques (par exemple, le mésoderme de la plaque latérale, le mésoderme paraxial, etc.) n’étaient observés que dans un sous-ensemble d’un cluster ou s’étendaient sur plusieurs clusters. Par exemple, la co-expression de TBX6 et MSGN1, qui marque le mésoderme pré-somitique, n’a été détectée que dans un sous-ensemble du groupe de mésoderme naissant. En revanche, la co-expression de HAND1 et GATA6, qui marque le mésoderme de la plaque latérale, pourrait être détectée dans plusieurs grappes de mésoderme, y compris la grappe de mésoderme naissante, au sein de laquelle des cellules avec une signature de mésoderme paraxial pourraient également être identifiées. Cela nous a amenés à conclure que les différents sous-types mésodermiques n’avaient pas encore clairement émergé à ce stade de la gastrulation, et que les cellules mésodermiques se regroupaient de manière transcriptionnelle sur le statut de maturation.

Un autre défi lors de l’utilisation de gènes marqueurs consiste à définir des types de cellules aux limites, qui peuvent représenter des populations de transition qui ont des aspects des signatures transcriptionnelles de deux ou plusieurs types de cellules. Des exemples de telles frontières comprennent celles entre l’endoderme et l’hypoblaste du sac vitellin, le mésoderme de la plaque latérale, le mésoderme somatique et extraembryonnaire ainsi que l’ectoderme amniotique et l’ectoderme de surface. Ce défi a été mis en évidence lorsque nous avons essayé d’annoter les types de cellules ectodermiques dans la gastrula humaine CS 7, qui comprenait à la fois l’ectoderme embryonnaire et extraembryonnaire (de l’amnios). Il existe un chevauchement important dans l’expression de marqueurs ectodermiques tels que DLX5, TFAP2C et GATA3, entre ces deux types de cellules. Un sous-groupement supplémentaire de la population d’ectodermes a révélé deux types de cellules distincts sur le plan de la transcription, l’un pouvant être annoté comme ectoderme amniotique basé sur l’expression de VTCN1 et une autre population que nous avons annotée comme ectoderme non neuronal. Cependant, comme l’ectoderme non neuronal se forme à la frontière entre l’épiblaste et l’ectoderme amniotique, nous n’avons pas pu déterminer si cette population représentait des cellules embryonnaires telles que l’ectoderme de surface ou des cellules immatures en cours de différenciation en ectoderme amniotique.

Une ambiguïté similaire existe dans la catégorisation du mésoderme extra-embryonnaire de l’amnios et du sac vitellin, qui sont continus l’un avec l’autre (Fig. 3a). Dans les premiers embryons de souris gastrulant le pli de la tête (environ E7.5 à E8.0), la périostine est couramment utilisée comme marqueur du mésoderme amniotique. Cependant, son expression s’étend au-delà du mésoderme amniotique dans le mésoderme recouvrant le sac vitellin (Fig. 3), ce qui en fait un marqueur plus généralement du mésoderme extra-embryonnaire. Nous sommes en mesure de déduire que le groupe transcriptionnel du mésoderme extra-embryonnaire exprimant la périostine dans l’embryon CS 7 représentait probablement le mésoderme du sac vitellin, car la majorité des cellules de ce groupe transcriptionnel ont été collectées à partir du sac vitellin. Cela démontre l’avantage de pouvoir exploiter même des informations anatomiques simples dans l’annotation des types de cellules. Cela nous a obligés à sous-disséquer la gastrula CS 7 en trois grands domaines anatomiques (sac vitellin, disque embryonnaire rostral et caudal) avant de la désagréger en cellules individuelles. Ces informations anatomiques étaient également importantes pour distinguer l’endoderme du sac vitellin des cellules hypoblastiques contiguës.

Si l’on ne commence pas par connaître l’origine anatomique des cellules séquencées, on peut aussi aller dans l’autre sens, et visualiser la distribution anatomique des cellules appartenant à des clusters transcriptionnels en utilisant l’expression intersectionnelle de multiples marqueurs de ce cluster. Le développement de méthodologies, telles que l’hybridation in situ par fluorescence d’ARN HCR, permet désormais la détection multiplexée de l’expression de plusieurs gènes à une résolution unicellulaire dans des échantillons de montage entiers. Alors que seule une poignée de gènes peuvent être évalués, les données de résolution unicellulaire 3D générées permettent de caractériser avec précision les profils d’expression spatiale. Cette caractérisation à haute résolution de l’expression combinée à la transcriptomique permet de cartographier très précisément les clusters transcriptionnels, fournissant des informations biologiques importantes. À l’autre extrémité du spectre, les approches de transcriptomique spatiale se développent rapidement, fournissant des méthodologies qui permettent le profilage spatial de milliers de gènes, mais généralement sur des tissus sectionnés, ce qui rend difficile la reconstruction d’informations 3D complètes. Néanmoins, ils fournissent des informations précieuses sur la localisation anatomique des cellules séquencées. L’application de ces technologies transcriptomiques unicellulaires aux embryons humains précoces nous permettra de mieux comprendre comment les profils moléculaires spécifiques au type de cellule varient en fonction de l’emplacement spatial pendant la gastrulation et le développement.


Pour aller plus loin :

Richard C.V. Tyser, Shankar Srinivas, Recent advances in understanding cell types during human gastrulation, Seminars in Cell & Developmental Biology, 2022. doi : 10.1016/j.semcdb.2022.05.004

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